在蛋白质结构解析与生物制药研发中，二硫键是维持蛋白高级结构稳定性的关键共价连接。尤其是在抗体药物、重组蛋白及复杂生物制剂中，二硫键的正确配对直接决定了蛋白的折叠状态、生物活性与安全性。因此，基于 LC-MS/MS的二硫键映射分析已成为蛋白质组学与结构生物学中的核心技术之一。

一、LC-MS/MS二硫键映射分析的基本原理

LC-MS/MS二硫键映射的核心目标，是在保持或选择性破坏二硫键结构的前提下，通过质谱技术识别连接两个半胱氨酸残基的肽段组合关系。

其基本逻辑包括：

• 蛋白酶解后形成含二硫键的交联肽段
• LC分离复杂肽混合物
• MS/MS碎裂获得肽段序列信息
• 生物信息学分析重建Cys–Cys连接关系

二硫键映射强调的是结构完整性保留与交联信息解析，因此对样品处理与数据分析要求更高。

二、完整LC-MS/MS二硫键映射分析工作流程

1、样品制备与二硫键保护

样品制备是整个流程中最关键的起点，其核心目标是避免非特异性二硫键断裂或重排。

常见策略包括：

• 使用温和裂解条件（避免强酸、强碱、高温）
• 避免使用DTT、TCEP等还原剂（非还原模式分析时）
• 添加尿素或盐酸胍进行轻度变性，提高酶解效率
• 控制金属离子污染，减少氧化/重排反应

在工业级蛋白或抗体样品中，这一步往往决定后续数据质量的上限。

2、酶解策略优化（Trypsin / 多酶联合）

蛋白质需被切割为适合质谱分析的肽段，但二硫键会限制酶切位点的可及性。

常见策略：

• 胰蛋白酶（Trypsin）单独酶解：适用于结构较简单蛋白
• 多酶组合（Trypsin + Glu-C / Lys-C）：提高覆盖率
• 分级酶解策略：先部分解折叠区域，再进一步消化

关键目标是获得合适长度肽段（6–25 aa）以及保留完整二硫键连接信息的交联肽

液相色谱（LC）在二硫键映射中起到“分辨复杂信号”的作用。

常用策略：

• 反相高效液相色谱（RP-HPLC）
• 梯度优化（通常20–35% ACN区间增强分离）
• 延长梯度时间以提高低丰度交联肽分辨率

对于抗体或复杂糖蛋白体系，多维LC（2D-LC）可显著提升覆盖深度。

4、MS/MS数据采集策略

LC-MS/MS分析中，碎裂模式选择直接影响二硫键识别成功率。

常见策略包括：

（1）HCD（高能碰撞解离）

• 适合常规肽段分析
• 可产生丰富b/y离子
• 但对交联肽解析有限

（2）ETD/EThcD（电子转移解离）

• 更适合二硫键保持状态分析
• 可保留修饰信息
• 是二硫键映射的关键技术之一

（3）数据采集模式

• DDA（数据依赖采集）：适合探索性分析
• DIA（数据非依赖采集）：适合高覆盖定量分析

在高端蛋白结构分析中，常采用DDA + ETD组合策略以提高二硫键定位准确性。

5、二硫键肽段鉴定与数据库分析

质谱数据生成后，需要通过专业软件进行二硫键配对分析。

• 常用工具包括pLink / pLink2、Byonic、Protein Prospector、MassMatrix
• 分析核心包括：交联肽段匹配、Cys-Cys配对组合推断、MS/MS碎片离子验证、假阳性过滤（FDR控制）

6、二硫键网络重构与结构验证

最终目标是构建完整的二硫键连接图谱：

• 确定每个Cys的配对关系
• 验证是否存在错配或异构体
• 与理论结构（AlphaFold或晶体结构）比对
• 结合功能实验进行验证

对于抗体药物，还需重点分析重链-轻链二硫键、铰链区结构稳定性。

三、LC-MS/MS二硫键映射的关键技术挑战

尽管技术已较成熟，但在实际应用中仍存在多重挑战：

1、二硫键重排

样品处理不当会导致非天然配对，影响结构判断。

2、低丰度交联肽难检测

交联肽离子化效率低，容易被普通肽段信号淹没。

3、数据解析复杂

交联组合指数级增长，计算负担大。

4、大分子蛋白覆盖不足

单抗、融合蛋白等体系难以实现100%覆盖。

LC-MS/MS二硫键映射分析是一项融合样品制备、色谱分离、质谱检测与生物信息学分析的综合性技术。随着生物制药与蛋白质工程的发展，对二硫键解析的精度与深度要求不断提高。未来，该技术将进一步向高通量、高自动化与高结构解析度方向发展。在这一过程中，百泰派克生物科技通过整合先进质谱平台与定制化分析流程，持续为科研机构与生物医药企业提供高质量的蛋白结构解析服务，助力从基础研究到药物开发的全链条创新。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

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